丰台白血病检测的故事：从显微镜到数字PCR

摘要：

　　Alec Morley博士是澳 利亚弗林德斯 学血液病学系的传授。他多年来一向从事白血病的研讨。最初的对象是显微镜。当病人患上急性淋巴细胞白血病（ALL），有经验的病理学家会很轻松地找到很多白血病细胞。不外，Morley指出，一旦白血病细胞的比例降至1%以下，就无法用肉眼检测到。“这就是个黑匣子。”

Alec Morley博士是澳 利亚弗林德斯 学血液病学系的传授。他多年来一向从事白血病的研讨。最初的对象是显微镜。当病人患上急性淋巴细胞白血病（ALL），有经验的病理学家会很轻松地找到很多白血病细胞。不外，Morley指出，一旦白血病细胞的比例降至1%以下，就无法用肉眼检测到。“这就是个黑匣子。”
于是，Morley和他的同事开端寻找新的对象来打开这个黑匣子。最初，他们运用的是PCR，来检测ALL中的基因重排。定性检测是胜利了，但能不克不及定量呢？为了答复这一问题，他们将细胞造就中的办法运用在PCR上。

无穷稀释PCR
Morley曾经开辟出一种技巧来克隆淋巴细胞，以研讨体细胞突变。将发展中的细胞分派在多个孔中，他发明突变克隆的发展遵守泊松散布。于是，他将这一道理运用在PCR上，将细胞调换成分子。这一进程，他们称之为“无穷稀释PCR”，也就是数字PCR的前身。

然而，这是个相当艰难的试验进程。据其时负责这项工作的Simhee Neoh介绍，他要进行许很多多次手工稀释，以找到一个准确的稀释点。一旦找到，他还要开展多个PCR反响，跑胶，并用宝丽来相机来拍摄每个成果。只有当 量凝胶跑完之后，他们能力汇集成果，开展泊松剖析，并获得量化成果。污染也是个须要留意的问题，因为须要很多分歧的样品，并开展巢式PCR反响。
尽管进程很艰难，但他们的尽力终于获得了回报。研讨人员可以或许检测急性白血病的程度，这在治疗进程中经常产生变更。与显微镜比拟，他们能检测更低程度的白血病细胞。具体来说，是0.01%，而不再是1%。

敏锐度的极 进步让他们打开了ALL的黑匣子。据Morley介绍，应用这种数字PCR进程，“我们可以或许依据微量残留病的程度，将患者分成三组：有些会治愈，有些会复发，及中央组。这种分类被很多更 型的研讨所证实，成为治疗改进的基本。”
同时，研讨小组也在很多期刊上揭橥了他们的结果。最让人冲动的是，1994年在《柳叶刀》上揭橥文章，解释应用有限稀释PCR来高敏锐度地定量白血病细胞，可测定对治疗的响应，从而猜测白血病的预后。

Morley及其同事也在《Biotechniques》上揭橥了他们的数字PCR研讨，作为一种通用的定量办法。这篇文章被普遍引用，是数字PCR的早期主要文献之一。然而，即使他们获得了胜利，但Morley等人照样逐渐远离它，开端转向及时定量PCR。“这是个好办法，但不现实，”Morley说。

微滴式数字PCR

现在，Morley还在持续尽力寻找更好的办法来测定和监控白血病。他的公司，Monoquant，正在开辟一种技巧，应用患者的DNA来定量慢性粒细胞白血病（CML）。
为了简化这种DNA办法，Morley开端采取Bio-Rad的微滴式数字PCR（ddPCR）技巧，来测定CML中特有的BCR-ABL易位。Morley以为：“微滴式数字PCR就像之前Simhee手工开展的工作。每个液滴包括一个PCR反响，读取为阳性或阴性的荧光。不再须要辛劳跑上25块凝胶，你可在几分钟内获得20,000个液滴，并快速读取。”

这种 范围的液滴带来了定量目的序列所需的分辩率，而不须要尺度曲线，这也是相对及时定量PCR的一个利益。“我们信任，微滴式数字PCR将让我们实现更准确的BCR-ABL易位的定量。”
尽管在DNA程度定量BCR-ABL实现了更敏锐的检测，但它也须要患者特异的办法。每个易位产生在基因组中一个奇特的断裂点，但这些差别会在RNA转录进程中被剪接掉。为了获得足够的特异性，Morley创立了一个引物体系。“对分歧的患者有分歧的引物，而它们在效力上各不雷同，”Morley说明道。“微滴式数字PCR很少受到扩增效力差别的影响。我们以为这会使监管机构加倍看好我们。”

Morley也意识到适用性和准确性，因为他想要开辟普遍运用的诊断检测。他以为；“在分歧的仪器之间进行选择时，你须要真正懂得具体的需求。我们称之为各有所长（horses for courses）。Bio-Rad的ddPCR技巧带来了我们想要的，敏锐度程度知足我们的需求，并且它很快速。是以，这是显而易见的选择。”
“我选择血液学，是因为这是个器械可以或许量化的范畴。你能答复问题，因为你能测定它们，”Morley谈道。“这是个了不得的工作。测定是个了不得的工作。”事实上，Morley的平生都在存眷这种“ 海捞针的问题”，找到并定量一种很小但很主要的标记物，从而赞助患病的人们。

Morley一向信任，假如他可以提出准确的问题，就能找到可测定的谜底。从早期PCR技巧的立异，到现在运用微滴式数字PCR技巧，Alec Morley已经做到了这一点。