朝阳超高分辩率显微镜揭示细胞决裂进程的难解之谜

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瑞士科学家搭建了一个高通量3D超高分辩率显微镜，在全部细胞周期，对细菌骨架卵白FtsZ以纳米分辩率成像。

卵白是 多半细菌细胞决裂的要素，它们是抗体靶向下一代的症结身分。曩昔测验考试在全部细胞周期中获得一张两张的纳米级图像，都不克不及说明细胞周期的全部故事。

细胞决裂周期，FtsZ卵白在细胞四周形成一个条带，被称为Z环，在细胞决裂时起克制感化。

超高分辩率荧鲜明微镜办法，包含2D光激活定位显微镜、3D PALM和3D构造照明技巧（SIM）在内，都能在这个进程中看懂Z环组织，但却不克不及揭示条带的构造以及细菌与卵白之间的互相感化。

"Z环直径 概500nm，尺寸小，活体很难不雅察，"École polytechnique fédérale de Lausanne生物物理试验室的Seamus Holden传授说明说："以前的测量不克不及解决这个问题，因为他们没有特定标志、活体成像、高的3D空间分辩率、样本尺寸太 或研讨细胞周期卵白的才能。"

有了以上设法主意，Holden及其同事开辟新的软件和硬件，实现对上百个同步细菌的高通量PALM，主动化采集在统一细胞周期的几百个细胞的图像。

超高分辩率图像：C. crescentus细胞周期Z环的3D构造

"我们须要采集几百个视野下的PALM图像，时长几个小时，" Holden说："这显而易见须要主动化，所以我们搭建了高通量PALM."

据研讨者说，一个症结性冲破是开辟出开辟源运算-AutoLase-在PALM下，这可以主动掌握活性荧光基团的密度，让密度低到足以实现单分子定位。

"我们想出了一种运算方法，它能轻便而稳固的评估活性荧光基团的密度…窍门是估量单个像素能亮多久，再设置一个阈值，假如时光足够长，密度就相当高了。"Holden说。

研讨者以闭环模式应用运算掌握光敏激光，实现活化荧光基团的密度在目的规模内。

"一旦我们能治理这个，主动PALM就酿成可能，" Holden说："运算异常快，未来会扩大到 视野快速sCMOS的运用上。"

在主动PALM测量时，研讨者也设法去除削减分辩率漂移的身分，如稳固显微镜等。

Holden说："我们把物镜固定在架子上-铝架，不放在物镜转盘上，显微镜放在机柜里，与温度和蔼流隔断。"

研讨者还应用外部相差增长细菌明视野下的比较度，如许就能主动辨认它们了。

"Nikon Ti显微镜自带相差办法，所以现实上我们已经顺应了这些。"Holden弥补说。

研讨者说细菌模子的选择也异常症结。研讨者选择了Caulobacter crescentus，它的细胞周期要几个小时，而E CoIi的细胞周期仅仅20分钟。

Holden特殊指出，C. crescentus的细胞周期越长，他和他的同事越有可能为分歧细胞周期下几百个细胞的Z环成像。

"我们在PALM上位同步化细菌成像，所以在试验开端时，你成像的那些细菌都处于细胞周期的开端。那些后成像的细菌，处于细胞周期的最后阶段。" Holden说。

这些客服了光毒性， Holden弥补说: "这个原则同样实用于真核体系。"

应用主动PALM技巧，研讨者肯定了活体FtsZ细菌卵白Z环的3D构造，检测了细胞决裂时环形态的转变。

研讨者愿望这些成果最终有助于药物开辟者发明新的细菌细胞分别抗生素克制因子。

"假如想用超高分辩率显微镜做细胞周期试验，我们的技巧是很有效的，"Holden说："在细胞中期组装对细胞决裂起感化的卵白有很 一堆。如今我们也想去看看其他卵白是怎幺组织的。"