光学显微镜使用人CGRP受体活性GS蛋白复合物的低

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     降钙素基因相关肽（CGRP）是一种广泛表达的神经肽，在感觉神经传递中起重要作用。CGRP受体是降钙素受体样受体（CLR）B类蛋白偶联受体和1型跨膜结构域蛋白受体M的异源二聚体。可溶蛋白1（RAMP1）。在此，我们报道了人CGRP受体复合物与CGRP和GS蛋白等三聚体的结构。该结构通过低温电子显微镜测定，具有3.3的全局分辨率，受体修饰蛋白的跨膜结构域位于CLR跨膜区3, 4和5之间的界面上，并稳定CLR的胞外环2。仅与CGRP直接接触，这与CLR变构调节中的功能一致。分子动力学模拟表明RAMP1为受体复合物提供了稳定性，特别是在CLR胞外域的定位中。控制G蛋白偶联受体的功能。
    
     所有相关数据可从作者处获得，或包含在手稿或补充信息中。原子坐标和冷冻-电磁密度图已存储在编号6e3y的蛋白质数据库和带有条目EMD-8978的电子显微镜数据库中。
    
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     这项工作得到了莫纳什大学拉马乔蒂低温电子显微镜中心、澳大利亚卫生与医学研究委员会(NHMRC)项目(1120919)和NHMRC项目(1055134)的资助。戴德华是NHMRC职业发展研究员，陈凯是NHMRCJ马丁公司的研究员。詹姆斯·库克研究员是马斯登基金会的研究员，这两人都是新西兰皇家学会资助的。中华民国是皇家学会会员，感谢BBSRC（BB/M06833/ 1）的支持。乌洛斯和朱丽塔为其分析和技术支持，古德拉特为来自活动CTR的CLR初步同源建模，弗内斯、赵平和高尔为其有益的讨论。
    
     友一公司从事病毒生产、昆虫细胞表达、纯化、负染电子显微镜、数据收集和分析、冷冻电子显微镜样品的制备，负责模型的建立和改进，并协助手稿的制备。进行冷冻样品制备、相板成像、数据采集、电镜数据处理与分析，计算冷冻EM图，辅助原稿制作。博士生分子动力学模拟，协助原稿制作。科技部协助建立和改进模型，审稿，根据细胞分析和数据分析，审稿，对MRI手稿进行了初步分析。约翰逊博士和世界银行组织并管理了电压阶段开发项目。博士提供对CGRP受体的洞察力，协助数据解释和手稿审阅。摩根士丹利提供对B类GPCR的洞察力，协助数据i解读和审查手稿。在数据解释和手稿准备方面交换协助。中央情报局设计了分子动力学模拟以协助数据解释和帮助撰写手稿。邓文迪负责总体项目战略和管理、数据。分析和解释并协助撰写手稿。下午3点，负责总体战略和管理，数据解释和手稿写作。
    
     对这些序列进行注释以指示血凝素（HA）信号序列（红色高亮）、3C切割位点（灰色高亮）、标记（深橄榄绿色高亮）和希斯标记（紫色高亮）的位置。CLR和ram P1的跨膜螺旋结构域以绿色框架显示并突出显示。EM图谱中未分析的蛋白片段以黄色突出显示。侧链密度有限但主链密度有限的氨基酸S在模型中被剔除，在序列中显示为红色。
    
     A.未标记CLR-ram P1(野生型(WT)CLR-ram P1)和纯化的构建(HA-Flag-CLR and Flag-ram P1)的药理学，CGRP介导的cAMP在瞬时转染的COS-7细胞中的积累。N=5个独立实验，重复3次；数据均值+标准偏差B，表达和纯化。策略：从色谱洗脱曲线中排除C和络合物的最终尺寸。D、SDS—PAGE和考马斯蓝染色显示络合物中各组分的存在。
    
     伏相板复合体的显微照片（代表3180胶片）。高对比度的相板成像有助于稳健的颗粒选择，虽然颗粒是低聚焦和紧密堆积的。B，重新发布2D类平均结果。C，映射细化工作流程。d锐化，计算RELION.E，金标准傅立叶壳相关曲线，总标称分辨率为3.26.F。过拟合通过将所有原子随机移动到0.5来评估，并根据低温EM半图进行细化。在得到的模型和用于稀释的半图（绿色）、生成的模型和用于交叉验证的另一半图（红色）、以及最终的稀释模型和完整的图（蓝色）G之间，urve与CLR的TM4和TM2碱基的潜在脂质相互作用。
    
     显示受体、CGRP肽(不包括map中未解析的lyp24-Asn25-Asn26序列)、斜坡跨膜结构域和冷冻-EM密度图，以及所有7个跨膜螺旋和每个斜坡ECD螺旋的H8的模型。采用PDB中R1 ECD的刚体拟合模型:4rw G12,还显示Gαs-Ras结构域的N-末端(αH1)和C-末端(αH5)α螺旋,上标P表示降钙素基因相关肽的残留。
    
     研究了CLR(蓝带)和ram P1(橙带)的ECD骨架以及用X射线晶体学12(浅灰带)求解的分离的CLR-ram P1 ECD复合物的结构，在ram P1 ECD上对准了结构，对CLR环(环1-5)进行了注释，得到了CLR环1和环的序列。5在低温EM图中未被解析，用黑点箭头表示，CLR环4和5的主链位置的差异用蓝色（活性复合物）和灰色（孤立ECD复合物）点箭头表示，CGRP肽的位置用深红色表示。
    
     CLR-CGRP-ram P1-Galphaβ-Nb35(黑色，2.4us)、CLR-CGRP-ram P1-Galpha(371-394)紫色，2us)和CLL-CGRP-Galpha(371-394，蓝色，2us)的模拟。C和CGRP(叠加在T6 S17上)对半数N个端子有效。一般来说，冰冻-电磁密度图中缺失的片段对应RMSF高的区域，ECD整体拟合的难度是交流电。ECD(D55ECD-V63ECD)和Q107ECD-g109 ECD的缺失片段对应于最远离跨膜区的外环区。D55ECD-V63ECD显示更大主干RMSF为8，而Q107ECD-g109 ECD显示同样高的RMSF为7.5。A79 ECD-g81 ECD和p115 ECD-s117 ECD附近的RMSF亚峰值稍低，但在跨膜区仍可分辨(a)ICL3(h324 ICL3-s328 ICL3)和EC。L3（p356 ec3-e362 EC3）都含有缺失的残基，与RMSF高于4.5（B）。虽然CGRP与近端相互作用（无缺）区EC3，在这个区域有没有持续的相互作用的分子动力学模拟中，ICL的RMSF值（3.6）和ICL二（3）ARE高，造成茬（k1672.40）和e248 ICL ICL 2），但2 250骨架被分解，CGRP，26残基周围的山峰（C）RMSF对应三高度活动外残留（lyp24-asn25-asn26）不与CLR在向外扩展数据图（循环互动8）；这些残留物不能放置于电子密度。这三个残基形成铰链CGRP变化的CLR ECD的方向，特别是在RAM 1缺席；的RMSF价值更高，更高的末端，是战略的叠加双域性质的产品同时，CLR，但其相对值仍然有效。一些细胞外环的高活性是可见的视频（补充视频1-3）。
    
     分子动力学模拟中ram P1与CLR之间的氢键(6.4μs)。基于彩虹颜色标记将总持久性绘制到实验结构，其中不涉及深蓝色残基和高红色残基。斜坡1显示出精细的条带，肽显示出精细的白色带。显示了关键侧链，但对于间歇氢键，旋转体状态被修改为显示相互作用。相互作用网络中的残留物以相同的颜色标记。系统位于左侧。在右上方，CLR跨膜结构域和ECD的上部扩大；在右下方，视图在Z轴上旋转90度。RAM P1-CLR相互作用、R112R-E47ECD和D113R-t288e Cl2/h289;/h289 ECL 2所涉及的氢键是显著的。其它与稳定CLR和ram P1相互作用相关的氢键包括S107R-e47 ECD、R102R-D55ECD、H97R-q50 ECD、D90R-y49 ECD、D71R-r38ed和E29R-r119 ECD。表2.B显示了模拟过程中ram P1和CLR之间的接触（6.4s）。在实验结构中，残留侧链的总持久性以青栗标度绘制，其中青栗残基和高栗残基从未涉及。otted线）被描绘成薄带，而受体（实线）被描绘成厚带和透明表面。系统的整体拓扑在左侧。在右上方，最持久的相互作用包括RAMP残基和CLR ECD、W59R、I63R、Y66R、H97R和I106R help锚定αH3和αH2的C端RAMP 1区域(CLR ECD残基m42、T43 ECD、y46 ECD、y49 ECD、Q50 ECD和M53 ECD)。在右下角，ram P1与CLR跨膜结构域(即I123R、P126R、T130R、T134R和V137R)之间最持久的疏水相互作用(plus S141R)帮助将斜率跨膜螺旋锚定到CLR(TM3-TM5；CLR残基y277 ecl2、H289 ecl2、A3005.45、I2353.52、F2624.52、L2584.48和W2544.44)。
    
     首先，儿童发育丙氨酸突变。CR核心丙氨酸突变，突变残留物呈X -棒形式，突变残基对信号无影响，CGRP信号12, 23, 28、30, 31, 32、34, 37, 38的残留物也有明显变化，在透明中也有突出显示。CPK表示，并根据效果大小着色。黄色，90%关；暗橙，10-100次；红色，100-1000次；黑色，1000次。CR和RAMP的主干（实线）以透明的灰白色带显示。CGRP肽（虚线）在X -S中表达。滴答格式，碳原子为暗红色，极性原子为红色或蓝色。
    
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