显微镜反光镜混合法是结构的交响乐

大家好，这里是老上光显微镜知识课堂，在这里你可以学到所有关于显微镜知识，好的，请看下面文章： 和其他结构生物学家一样，伊娃·诺加莱斯也赶上了好时光。加州大学伯克利分校的教职员工现在可以使用新的工具来解决几年前无法解决的细胞和分子问题。
    
     Nogales和他的同事、分子生物学家和CRISP-Cas9的发明人之一Jennifer Doudna最近的合作就是一个很好的例子。他们都对R环很感兴趣。在很多情况下，在细胞被CRISPR-Cas9切割DNA之前，细胞就形成了核苷酸R环。对化脓链球菌的R-环进行成像，获得近原子分辨率的结构图像，提示Cas9酶如何在特定位置打开DNA，并将其作为CRISPR的分子剪刀使用。
    
     这项工作最突出的方面是科学家可以快速地将功能与结构联系起来，并且可以结合成像方法。一个多世纪以来，结构生物学的方法是X射线晶体衍射法。然而，有些生物分子太大或太大。由于晶体较小，因此不能采用X射线法，而且某些分子在起作用时可能会改变其形态或取向，结晶法无法捕捉这些变化。
    
     现在科学家拥有大量的成像工具库。低温化学显微镜或核磁共振（NMR）成像，如化学家，可以用来获得接近原子分辨率的结构图像而不结晶，从而揭示分子的形状、大小和方向。并非所有的方法都适用于活细胞中的所有蛋白质和核酸。
    
     经验表明，任何单一的方法都不足以研究细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。更好的解决方案是集成来自多个工具的图像。
    
     斯坦福大学的结构生物学家罗杰·科恩伯格指出，每种方法都提供了一些重要的信息，可以结合起来达到1+12的效果。科恩伯格因其对reve的贡献在2006年获得了诺贝尔化学奖。揭示基因的转录机制。为了这个突破性的研究，他采用了X射线晶体衍射法。现在，像其他晶体学一样，他已经开始结合各种方法。
    
     Kornberg继续分析RNA聚合酶II，但是现在他结合了低温电子显微镜和结晶学。与晶体技术相比，低温电子显微镜可以用于非结晶生物分子，并且可以分辨较大的分子，但是目前的分辨率很小。Kornberg还利用化学交联和质谱技术揭示了相邻蛋白质之间的关系，并使用已知的蛋白质信息建立同源性模型。
    
     同时，Nogales和Doudna团队也采用混合方法研究R环。Nogales指出，高分辨率X射线晶体方法无法解析完整的R环结构。所以他们使用低温电子显微镜在低分辨率下分析完整的R环结构。在这两个方面，研究人员能够真正揭示R环在CRISPR-CAS9中的作用。
    
     这种杂交或综合的方法有助于研究人员深入研究基本的科学问题，对药物开发者也是有用的。细胞膜上的大蛋白通常是治疗目标，而高分辨率杂交方法可以揭示药物-受体相互作用的原子细节。类似地，证明HIV、埃博拉病毒和其他病原体的包膜蛋白与免疫细胞相互作用的机制可能有助于疫苗的研制。纳什维尔范德比尔特大学的结构生物学家Jens Meiler说，这些结构对于理解imm的方式很重要。UNE系统工作。
    
     德国欧洲分子生物学实验室（EMBL）细胞生物学和生物物理学主任简·埃伦伯格说，对于许多生命科学家来说，这个时代是一个梦想成真的时代。这个梦想从原子水平到细胞水平都是无缝的。对细胞大分子的深入理解自然地回答结构生物学中的个问题：分子的结构如何与其功能相关
    
     结构生物学家工具箱中的每种技术都提供了不同的视角。生物学家相信使用混合方法建立的模型能够准确地反映细胞中分子或复合物的行为。梅勒说：你需要将这些技术结合起来才能得到全面的答案。
    
     X射线衍射是测定蛋白质的原子结构的标准方法，1971年成立的蛋白质数据库拥有的大约120000个模型中，约90％来自晶体学研究。
    
     然而，对于结构生物学家来说，虽然该技术具有高的分辨率，但是也有局限性。首先，样品需要高度纯化以产生有序的晶体。科学家通过分析原子如何散射光来确定分子结构。产生可测量的衍射图案，并且每个晶体必须是静态的。因此，这种方法不能揭示分子如何运动和工作，也不能揭示分子如何与其他系统相互作用。
    
     德国复杂系统研究所计算结构生物学小组组长Gunnar Schroder指出，蛋白质不仅仅是一个单一的静态结构，你想看到的是整个蛋白质是如何工作的。晶体技术可以提供正常环境中蛋白质的快照。但是结构生物学家需要其他方法来补充晶体结构信息，并提高他们对蛋白质形态和功能的理解。
    
     此外，许多蛋白质，如细胞膜上的药物靶标，是灵活和不稳定的。为了让这些蛋白质形成晶体，研究人员常常要在一定程度上改变它们。他把实验和计算方法结合起来，以便更好地理解分子结构。晶体方法是一种好的初始方法，但是这种方法不足以提供功能信息。他说。
    
     诺加莱斯等。使用混合策略实现10A的总分辨率，与先前的30A的分辨率分析相比，这是一个很大的改进。提高的分辨率为氨基酸与DNA的相互作用提供了新的见解，如Nogales所说。
    
     但是冷冻电子显微镜需要冷冻样品。这是不理想的，因为冷冻样品远离它们的动态和自然状态。NMR光谱可以解决这个问题。Schroder说NMR有很大的优势。你可以在室温下观察样品，获得有关蛋白质动力学的信息。他的实验室通过结合核磁共振、低温电子显微镜和结晶学数据建立了一个实验模型。
    
     核磁共振应用于实验是在20世纪40年代，研究人员在外加磁场中激发原子以获得大分子结构，当原子恢复时，可以检测到其内部磁场的变化，从而反映分子的原子结构。仅适用于相对较小的大分子或络合物。
    
     结构生物学家也使用杂交的方法来分析超大复合物——以前不可能完成的任务。Kornberg的最新工作进一步扩展了他对RNA聚合酶II的研究，并使用杂交的方法来描述一个由50多个蛋白质和tra组成的庞大复合物。刻字因素。通过多种方法的结合，他们首先看到了整个复杂性。每个方法的贡献也很大。他说。
    
     虽然不同的方法能带来更多的信息，但是混淆会导致错误的重叠。因此，混合方法的一个潜在问题是由多个误差源引起的误差增加。所得模型准确、准确、可靠。
    
     另一个障碍是多类数据集的共享和利用。任何技术都可以获得丰富的信息，因此信息共享都是一个挑战。冷冻电子显微镜制造商FEI的首席科学家Jeffrey Lengyel说，每天产生数百万兆字节的数据。指出结构生物学领域将向高通量遗传生物学领域学习如何处理数据过载。虽然有软件可以灵活地将高分辨率晶体结构数据与冷冻电子显微镜相结合，但其它方法得到的数据却是相同的。电子顺磁共振（EPR）光谱测量聚合物的距离和方向，而冷冻电子显微镜则产生密度图。虽然这两个数据一起非常有用，但是这两个数据语言是不同的。问问题。如何整合这些数据以及如何共享它们
    
     为了探索组织、共享和使用数据的更佳方式，2014年10月，数十名结构生物学家聚集在欧洲生物信息学研究所。目前，PDB存储关于单个蛋白质结构的数据，并应该添加关于蛋白质所有方面的数据，Schroder说。ILS，蛋白质和高分子功能的更全面的分析。
    
     学术界作出了一些努力：建立了二维电子显微镜图像档案和三维EMDataBank，这些档案由EMBL等机构提供资金，这些机构包含可以共享、归档和分发的数据。
    
     另一个可能阻碍该领域的威胁是专业知识。梅勒指出，技术需要投资，但培训科学家的投资也很重要。他建议结构生物学的学生学习每种方法的利弊，至少掌握一种。新一代科学家了解如何整合这些不同的技术。
    
     最后，结构生物学家必须学会对以前认为不可能的新的、复杂的生物学问题提问。艾伦伯格说，由于采用了混合方法，许多我以为在五年前退休之前甚至不能探索的问题。
    
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