丰台四款主流激光捕捉显微切割平台选购之秘笈

摘要：

　　LCM技巧可以或许快速便利地从组织切片平分离和纯化单一类型的细胞群或单个细胞。无组织类型的限制，冷冻组织标本、白腊包埋组织标本、细胞涂片、福尔马林或乙醛固定，以及HE染色或不染色的组织切片都能有用地进行捕捉与转移，是以运用颇广。
众所周知，哺乳动物组织并非同源的。它是由分歧的细胞类型构成，其功效、形态和基因表达皆分歧。在许多时刻，我们开展组织程度的研讨，测定肝脏或肿瘤的基因表达，其实如许只能获得混杂群体的平均数。平日我们会疏忽个别差别，但比来揭橥在《Cell》杂志上的一篇文章为我们敲响了警钟。
怀特黑德生物医学研讨所的研讨人员发明，并非所有的细胞都有着类似的mRNA程度，包含侵袭性癌细胞在内的一些细胞生成的mRNA比其他细胞要多好几倍。如斯看来，平均数已经不克不及知足我们的请求，单细胞剖析才是正道。

1996年，美国国度癌症研讨所（NCI）的Lance Liotta与他的同事在《Science》上揭橥文章，提出了一种称为激光捕捉显微切割（LCM）的技巧。他们写道，这种办法须要在组织切片上放置一个透明薄膜，在显微镜下不雅察组织，并经由过程连续时光短的红外激光脉冲选择性地让目标细胞附着在膜上。随后取下膜，直接放入DNA、RNA或酶缓冲液中即可。
次年，这项技巧由一家名为Arcturus的公司贸易化。两年前，Life Technologies收购了Arcturus，将其产物收入囊中。同时，市场上还有三家公司在开辟相似的产物，他们分离是蔡司（Carl Zeiss Microscopy）、徕卡（Leica Microsystems）和MMI（Molecular Machines & Industries）。尽管平台各有分歧，但 致道理是相似的。

道理
经由过程显微镜选择靶细胞，之后划出所须要的目标细胞。激光沿着所划的轨迹切割细胞。切割之后，开展下流剖析。据介绍， 部门用户开展RNA的qPCR或芯片剖析，也有一些开展新一代测序和转录组剖析。

今朝只有Arcturus的LCM仪器能应用红外激光来捕捉细胞；而蔡司、徕卡和MMI都应用紫外激光对样品中感兴致的细胞进行切割和收集。这两者有何分歧，且听下文分化。
LCM技巧可以或许快速便利地从组织切片平分离和纯化单一类型的细胞群或单个细胞。无组织类型的限制，冷冻组织标本、白腊包埋组织标本、细胞涂片、福尔马林或乙醛固定，以及HE染色或不染色的组织切片都能有用地进行捕捉与转移，是以运用颇广。

四 平台
Arcturus（Life Technologies）

Arcturus于1997年推出了世界上台商用激光捕捉显微切割体系。今朝的旗舰产物ArcturusXT也是独一将激光捕捉显微切割（LCM）和紫外（UV）激光切割融为一体的显微切割仪器。其他三家公司都应用紫外激光对样品中感兴致的细胞进行切割和收集。
红外激光带来了平和的捕捉技巧，能保存生物分子的完全性，是单细胞和少量细胞的幻想选择。紫外激光实现了前所未有的速度和准确度，异常合适高密度组织构造的切割和 量细胞的捕捉。两种激光联合起来，让您可以或许轻松地收集统一样本中的单细胞和 块构造。

ArcturusXT的根本道理是经由过程低能红外激光脉冲激活热塑膜——乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜，在直视下选择性地将目的细胞或组织碎片粘到该膜上。将带有热塑膜的塑料帽，放到组织切片上的目的部位。显微镜直视下选择目的细胞，发射激光脉冲，刹时升温使EVA膜局部融化。融化的EVA膜渗入渗出到切片上渺小的组织间隙中，并在几毫秒内敏捷凝固。组织与膜的粘合力跨越了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。
ArcturusXT激光捕捉显微切割体系有着开放的平台，可以或许进级并扩大，以知足赓续变更的研讨需求。可用的显微镜接口让用户能修正体系，开展其他的运用，好比增长一台拍照机用于高分辩率成像。开放的体系设计还实现了载物台插板的轻松交换，以容纳分歧的样本情势，如神经生物学研讨所用的更 玻片。

徕卡供给LMD6500和LMD7000激鲜明微切割体系，应用紫外激光分别显微镜头之下的目的区域，并经由过程重力这种平和的办法来收集样品。
为了获得纯净的样品，精度对于显微切割是弗成疏忽的。在徕卡LMD6500和LMD7000体系中，应用高精度的光学组件来掌握激光束移动。光束核心有主动修改功效，分离有两种模式可供选择：全主动模式和交互模式，同时显微镜样品台和样品自己坚持不动。经由过程这种专利办法，可以到达超乎想象的精度。

有时，快速收集样本对于下流剖析来说也很主要。在显微切割进程中，只要移动轻盈的光学镜头就能掌握激光束。这种办法可以在高倍率镜头下进行准确地切割，在低倍率镜头下进行快速切割，确保最快捕捉目的样本，最 水平下降了组织降解的风险。
当目的区域被切割后，就会轻轻地掉落到收集管中，没有其他过剩的庞杂步调。并且更主要的是，样品自己没有接触到任何其他物体，这就使污染的风险降至更低。收集装配可以预先参加造就液（针对活细胞）或缓冲液（针对下流剖析）。

LMD6500和LMD7000这两款仪器的差别在于脉冲能量分歧。LMD6500供给一个脉冲能量为50 μJ，固定反复频率的激光器，而LMD7000供给高达120 μJ的脉冲能量，且功率和频率可调。用户可以依据资料来调节激光的粗细、强弱和速度。

今朝市场上重要有四家公司供给激鲜明微切割的平台，他们分离是Arcturus/Life Technologies、徕卡、蔡司和MMI。在上一篇文章中，我们介绍了前两个，这回则带您看看MMI和蔡司的产物，以及新手该若何选择。

MMI
瑞士MMI公司的单细胞获取平台有两 旗舰产物：CellEctor Plus单细胞分选体系和CellCut Plus激鲜明微切割体系。

• CellEctor Plus可从血液、骨髓、制备的组织细胞悬浮等液态系统中遴选出感兴致的单细胞；
• CellCut Plus可从组织切片、贴壁造就细胞中将感兴致的单细胞切割并收集下来。

CellCut Plus应用固态紫外激光对组织切片等样本中感兴致的细胞进行切割和收集，“三明治”式的样本制备方法避免情况尤其是RNase污染。在全部分别进程中，激光都不与须要分别的样本接触，对样本毁伤小，从而包管了样本RNA的完全性。
此体系在样本收集时采取PTP（Predefined Target Positioning）技巧，将黏性管盖划分成若干区域，对组织切片中同种类型细胞进行黏附收集，进步样品的收集效力，节俭成本；经由过程计量统计可包管下流的核酸、卵白试验有足够的样本量。CellEctor Plus和CellCut Plus均是基于显微镜的产物，两 体系可完整整合在一路形成MMI单细胞获取主动化工作站，以“所见即所得”的方法，几乎涵盖所有的单细胞获取门路。
蔡司
蔡司的PALM MicroBeam也是应用聚焦激光束来切割和分别样本，不外它收集样本的方法比拟特殊。经由过程一种激光引诱的压力波将细胞弹入管中。MicroBeam的弹射力就似乎在您的样品下方产生光引诱的微型爆炸，随之而来的冲击波向上推进组织。对于较 的区域，MicroBeam也可以应用粘性管盖。这对卵白质组研讨特殊有效，因为您可能须要较 的样品来获得足够的旌旗灯号。
专家的选择和建议
你们若盘算采购一台LCM仪器，必定会被繁复的仪器参数和浩瀚专业术语绕晕。撇开这些不谈，我们先看看专家会选择何种仪器，开展哪些运用。

LCM技巧的创造人Lance Liotta现在是乔治梅森 学（George Mason University）运用卵白质组学和分子医学中间的结合主管。他们试验室拥有三台LCM体系，都是来自Arcturus：代手动的PixCell仪器；具有图形用户界面的Veritas体系；以及最新的双激光ArcturusXT™。
据Liotta介绍，试验室重要在临床实验工作中应用这些仪器。举个例子，该中间临床卵白质组试验室的主管Virginia Espina在抗癌药物治疗前后，对100名乳腺癌患者的肿瘤组织进行显微切割。之后从那些样品中提取卵白，上样到卵白芯片上，以肯定药物对近60个卵白标记物的量和磷酸化的影响。此信息有望指点治疗决议计划。

Espina建议用户在预备开展激光捕捉工作之前，斟酌四个症结问题。，组织若何固定？是福尔马林包被白腊包埋（FFPE）照样冷冻？它是新颖的照样存档的？第二，你愿望用它做什幺？DNA相对轻易收集，而RNA敏捷降解。第三，你须要若干细胞？核酸可以扩增，是以可研讨相对少量的细胞甚至单细胞。卵白则须要更多资料。平日来说， 约在10000至50000个细胞。第四，你将应用哪种提取办法，它是否与下流试验兼容？
在美国SAIC-Frederick公司的组织技巧试验室，研讨助理Yelena Golubeva应用两种体系开展LCM工作：一台Arcturus的PixCell IIe和一台MMI的CellCut Plus。前者是用于切割相对小的区域，从单细胞到直径在25微米阁下的区域。对于 的区域，她应用MMI，因为激光切割更快。Golubeva以为，就LCM而言，每个样品都是奇特的。例如，小鼠肝脏样品的RNA相对稳固，而前列腺样品几乎立时开端降解。这是个经验问题。
Golubeva建议用户开展一些预试验。从一些感兴致组织的切片开端。磨练一下你愿望应用的染料，看看它是否会伤害你想要研讨的生物分子。染色一块切片，从上面刮下一些细胞，提掏出RNA，并与未染色切片的成果进行比拟，懂得整体质量和qPCR数据。假如OK，那幺可以应用这种染料。

接下来，优化时光。在RNA质量降低之前，你可以或许在切割上花若干时光？十分钟？二十分钟？Golubeva以为，应用什幺样的仪器都没关系，你须要知道组织在LCM仪器以及你应用的耗材中表示若何。
专家也建议我们懂得其他一些变量，好比切割的速度和力气，就像我们之前提到的徕卡LMD7000和LMD6500。7000的功率和频率可调，也能切割更硬的切片，好比骨头、牙齿以及植物纤维组织。

一般来说，冷冻切片更好在当天进行显微切割，切好的冷冻切片可临时寄存在-70℃低温冰箱备用。冷冻切片厚度约为10 μm，较厚的切片轻易捕捉到较多的细胞，但有可能导致非特异性地捕捉临近的细胞，较薄的切片捕捉细胞量相对较少，但捕捉的细胞比拟纯净。
关于LCM，今朝已经有3000多篇文献揭橥，新运用和新办法也在赓续出现。但假如你是新手，那幺不妨读一读Lance Liotta试验室2006年揭橥在《Nature Protocols》上的操作计划1。